脐带间充质干细胞原代分离有困难？不妨看看这篇文章......

自友康正式发布GMP级间充质干细胞无血清培养基后，很多老师前来咨询：

你们的原代分离工艺是否有变化啊？

我怎么养了好几天还没有看见细胞爬出啊？？

我怎样操作才能分离尽可能多的原代细胞，做出你们展示的数据啊？？？

。。。

莫慌！小编在这里带着大家梳理一下友康体系脐带MSC的分离及传代工艺，本工艺适用于新款及老款的无血清培养基。

1. 将医用剪刀、组织镊、手术柄、手术刀等器械提前灭菌。

2. 150mm培养皿或T-175培养瓶。

3. 将5mL培养基因子添加于一瓶500mL培养基中，配制为wan全培养基

1. 用含25mg/L庆大霉素的DPBS清洗脐带3遍，后用不含庆大霉素的DPBS清洗脐带至清洗液无血色。

2. 使用医用剪刀将脐带处理成2cm大小的组织段，每段组织沿脐带静脉将脐带剪开。

3. 使用组织镊撕去脐带静脉内膜、外皮、两根动脉使华通氏胶充分暴露。

4. 使用手术刀将华通氏胶剪切成边长 3-5mm 的小块，每2cm组织段切成的华通氏胶小块接种于一个150mm培养皿中使组织块均匀分布，添加10mL-15mLwan全培养基。

特别提示：此处组织块的大小极为关键，组织块过小不易贴壁，细胞难以爬出；组织块过大细胞爬出时间将延后，3-5mm边长是友康测试最为合适的大小。

5. 24-48h 后，补充wan全培养基至30mL。

6. 7天全量换液。

7. 10天全量换液。

8. 12-14天收获原代细胞。

使用其它表面积培养皿接种量如下：

1. 培养72h后，在显微镜下观察培养的MSC细胞，当细胞融合度达到 90%，即可传代。

特别提示：

细胞融合度请勿超过100%，特别是切勿使局部过密，导致叠层生长，甚至聚集成球，会导致细胞严重衰老及分化。再者传代前细胞生长过密（细胞融合度过高），导致细胞消化异常（细胞整片或成片脱落），加之随后的不当操作（用移液器反复吹打成片细胞使其成为单个细胞），此操作所导致的机械损伤会严重损害细胞膜，引发大比例的细胞死亡，特别是这些细胞经冻存后再次使用时。

2. 在超净台中，弃去培养瓶中的培养液，加入10 mL PBS清洗细胞后弃去。

3. 加入3 mL 干细胞温和消化酶常温下消化细胞。

4. 在显微镜下观察到细胞全部收缩变圆，且有少量细胞开始流动时（一般2-5分钟），立即加入温和酶使用量2倍体积（6mL）的细胞培养上清或者wan全培养基稀释细胞悬液。

特别提示：

使用培养上清液或wan全培养基稀释温和消化酶（货号：NC1004.1）对细胞有较好的保护作用，比使用DPBS等缓冲液会多

回收10～30%的细胞，而且培养上清液或wan全培养基能够更好的保持细胞活性，能一直维持较高的扩增倍数。

5. 用移液器轻轻吹打瓶壁上未wan全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞wan全分散。

特别提示：

进行该操作时动作一定要温和，因为细胞消化过程中的细胞损伤，更多的是来自于类似吹打与离心的机械损伤。

6. 将细胞悬液转移到15 mL 离心管中，300g离心5 min。弃上清，加入2mLwan全培养基重悬细胞，使用台盼蓝染色，或流式细胞仪等方法计数。

7. T175瓶加入35mLwan全培养基。按密度8000 cells/cm2 接种细胞。

特别提示：

应让培养基沿培养瓶的上表面（细胞生长面的相对面）或侧表面加入，切忌冲到培养瓶底面，否则容易在培养基冲刷到培养瓶底面位置出现细胞生长空白区域。

离心步骤不可去除，干细胞温和消化酶短时间内对细胞无损伤，但切勿超过10分钟。

8. 将培养瓶置于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养。