干细胞养成记

干细胞是怎样“养出来"的？

一、清洗与分离：获取富含MSC的“华通氏胶"组织

1、材料准备

新鲜脐带组织（最好在出生后36小时内处理）

无菌PBS（磷酸盐缓冲盐水）、无菌手术刀、无菌剪刀/镊子、10cm无菌解剖皿、50ml离心管

2、去除杂质

将脐带置于无菌解剖皿中，用PBS反复冲洗，去除残余血液及运输液体。

建议切割成约5cm的小段，便于后续操作。

3、分离血管与华通氏胶

在每一小段脐带上纵向浅切一刀，注意不要切穿血管。

用镊子轻轻扒开脐带，露出中央的两条动脉和一条静脉。

用镊子将血管连同包裹的白色胶状组织（血管周围的“华通氏胶"）分离出来。

小心操作，尽量避免损伤血管内皮层，减少其他细胞污染。

4、剥离与切块

剥离下来的“华通氏胶"组织，用剪刀/手术刀切成1~3mm见方的小块，保持组织湿润，避免干燥。

组织块可暂时放在含PBS的离心管中，静置备用。

二、切割与铺板：为细胞“安家"

1、准备培养器皿

选择适合的培养瓶（如T25、T75等），事先用适宜的细胞贴壁底物处理（常见为胶原或专用贴壁液），按说明书比例稀释并包被，室温静置2小时后备用。

2、移植组织块

用宽口移液器或无菌镊子，将1~3mm见方的华通氏胶组织块均匀放置在培养瓶底部。

建议每瓶间距均匀，不要堆叠，确保每块都有接触瓶底的机会，有利于贴壁。

3、添加培养基

缓慢加入预热好的间充质干细胞专用培养基，通常8~10ml/瓶（以T75为例），覆盖组织块但不宜太多，以免组织漂浮。

4、初期培养

放入37℃、5% CO₂培养箱，静置5~7天，期间不宜移动，以便组织块稳定贴壁。

观察培养基颜色，不宜wan全变黄或干涸，必要时可补充部分新鲜培养基。

三、培养与换液：细胞“爬出"与扩散

1、首ci换液

培养5~7天后，大多数组织块已牢固贴壁，可进行“半量换液"：倾斜瓶体，用移液器吸走一半旧培养基，慢慢补充等量新鲜培养基。

轻操作，避免扰动组织块。

2、后续观察

继续培养，每3-5天换液一次。随着时间推移（通常10-14天），会发现细胞逐渐从组织块“爬"出，铺展在瓶底，数量逐渐增多。

3、细胞长满（融合度70~80%）时处理

细胞生长速度根据组织块数量、初始样本质量等因素略有不同。一般10~18天左右，细胞可达到传代标准。

四、收获与扩增：获得大量MSC

1、去除组织块

先弃去培养基，用PBS轻轻冲洗瓶底，去除未贴壁的组织块及漂浮细胞。

2、消化收获

加入适量细胞消化液（如胰酶/胶原酶混合液），37℃孵育6~8分钟。

轻轻拍打瓶壁，显微镜下观察，细胞开始脱落。

3、终止消化与收集

加入等体积含血清或专用消化终止液终止反应。

用细胞滤网（70μm）过滤，收集单细胞悬液，弃去残余组织块。

4、离心与再接种

300g离心10分钟，弃上清，PBS重悬。

细胞计数，按1500~3000个/cm²密度接种到新培养瓶中，继续扩增。

2-3天后细胞可达70-80%融合度，再进入下次传代。